Hartung-Gorre
Verlag
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S
März 2010 |
Reinhold
Weber,
Analytische Entwicklung und
bioanalytische
Anwendung von hochauflösenden Methoden
der massenspektrometrischen Proteomanalytik.
Konstanz 2010. 202 Seiten, € 64,00.
ISBN-10 3-86628-303-2
ISBN-13
978-3-86628-303-9
Massenspektrometrische Methoden stellen eine Schlüsseltechnologie in der Proteomanalyse dar. Insbesondere durch die Implementierung der weichen Ionisierungsarten MALDI und ESI in Kombination mit effektiven gelelektrophoretischen und chromatographischen Trennverfahren ist die Identifizierung von Proteinen sowie posttranslationalen Modifikationen im unteren pmol-Bereich standardmäßig möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden als neue Ionisierungsmethoden Chip- und Nano-ESI sowie IR-MALDI an einem Bruker Apex II FTMS entwickelt und proteomanalytisch angewendet. Das Mikrochip-System bietet neben den kleinen Flussraten insbesondere den Vorteil der Implementierung von Probenreinigungs- und Konzentrationsschritten, wie am Beispiel der Analyse der Phosphorylierung des Tau-Proteins demonstriert wurde. Tyrosin-nitrierte Peptide fragmentieren unter UV-MALDI-Bedingungen, während sie durch IR-MALDI intakt analysiert werden können. Durch optimierte Probenvorbereitung konnten photolinker-gebundene Peptide einer kombinatorischen Bibliothek direkt mit dem MALDI UV-Laser desorbiert und fragmentiert werden. Das Ubiquitin-Proteasom-System spielt bei der Antigenprozessierung eine zentrale Rolle. Antigene Proteine werden enzymatisch mit einer Polyubiquitinkette markiert und im 20S Proteasom zu Peptiden abgebaut, die als Ligand für MHC I fungieren. Mittels in-vitro Abbauten und LC-MS-Analyse war es möglich, sowohl den Einfluss der Art des Proteasoms (konstitutiv vs Immun) als auch der Untereinheit b1i auf die Prozessierung eines synthetischen Substratpeptids zu untersuchen. Im konstitutiven Proteasom aus Mäuseleber und Intestinum konnten durch 2 D Gelelektrophorese, tryptischen in-Gel Abbau und peptide mass fingerprinting nach FTMS auch die beiden induzierbaren Untereinheiten b1i und b2i gefunden werden. Zur Untersuchung des molekularen Markierungsprozesses mit Ubiquitin wurde die Ubiquitin-Proteinligase E6-AP proteomanalytisch mittels nano-ESI FTMS untersucht. Dabei konnten sowohl eine Phosphorylierung als auch eine spezifische Ubiquitinierung an der e-Aminogruppe von Lys468 detektiert werden.
Schlagwörter / Keywords: FTICR-Massenspektrometrie, UV- und IR-MALDI, Chip- und Nano-ESI, on-bead-Peptidsequenzierung, proteasomaler Proteinabbau, Proteasom-Proteomics, Ubiquitinierung, Ubiquitin-Protein-Ligase
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